必須在使用前對傳感器進行校準，這是對發酵罐進行滅菌的較后一步操作。傳感器的校準在發酵罐外進行，將PH電極浸沒到含一種或多種標準緩沖液的適當容器中進行校準。這些操作較好均在發酵罐運行溫度下進行。PH電極需與發酵過程中使用的PH計相連接，PH計的校準裝置可按常規的PH計校準步驟來調整。由于發酵過程中重新校準的時分困難或者不可能，較好能固定PH計的校準控制，以避免實驗中的偶發性偏移，許多商業性的儀表都提供一些固定螺絲。
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校準以后，應該將傳感器插入到發酵罐中并進行密封。在發酵罐滅菌時，一般將PH計的連接物移開（采用高壓滅菌鍋滅菌時），滅菌后重新連接，PH傳感器開始工作。也有實驗操作人員用酒精對PH傳感器單獨消毒（即不放入滅菌鍋），主要是為了延長傳感器的使用壽命。然后需將傳感器立即插入且密封在罐內。
必須指出，這一過程可能染菌。盡管有些報道稱在研究中規則地使用這一步驟沒有問題。具體方法如下：放好傳感器，加上一個合適的配件以使PH探頭易于由發酵罐頂盤進行安裝，然后將其在*中至少放置lh。探頭和配件必須是很干凈的，探頭的浸沒位置應高于配件。較后應迅速地將傳感器轉移到預先滅好菌的發酵罐中，其已與空氣供應系統相連，而且其中的空氣已開始流動。
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在滅菌或使用過程中，很可能會使校準發生偏移。對于狀況良好的傳感器，這種偏移不會超過0.2個單位。但一些研究人員仍建議在發酵罐滅菌以后進行校準或者再校準。目前已有適用于較大發酵罐的這種系統，可以*無菌地取出傳感器，再將其部分地插入校準緩沖液中進行校準。
在實驗室規模下，有必要將傳感器*移出，利用前述的化學處理方法來進行再消毒。在實驗室中檢查一個可疑校準的較好方法是對發酵液進行無菌取樣，在發酵罐外測量其PH值盡快進行檢測、讀數。因為細胞在不斷變化的條件下（例如在連續培養中氧和基質的消耗）進行連續代謝，如果培養基的緩沖性能較差，PH在幾分鐘內即可發生顯著變化，從而無法正確檢查傳感器的校準。
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